Трегалоза вытянула из сухого вещества половину остаточной воды и остановилась. Дальше воду забрал не сахар: альбумин — сывороточный белок, который стоит в рецептуре вспомогательным веществом, а не продуктом, — добавленный к той же трегалозе, довёл остаток с 0,06 до 0,01 грамма на грамм сухой массы.
Шестикратная разница пришла от компонента, который воду не вытесняет вовсе. Его работа в другом: держать температуру, выше которой сухое стекло перестаёт быть стеклом. Поэтому «или» в заголовке лишнее — трегалоза и альбумин стоят на разных осях одной рецептуры, и подменить одну ось другой не выйдет.
В опубликованном эксперименте клетки сушили в трёх вариантах одной и той же среды. Без добавок остаточная влага сухого вещества составила 0,12 грамма воды на грамм, с трегалозой — 0,06, с трегалозой и бычьим сывороточным альбумином вместе — 0,01. Первый шаг сделал сахар. Второй сделал белок, и сделал его не увеличением дозы сахара: третий состав отличался от второго именно добавленным белком. Что означает конкретное число остаточной влажности, почему у неё две границы, а не одна, и откуда вода возвращается к уже закрытому флакону — разобрано в статье «Остаточная влажность: от чего зависит срок годности». Здесь важно другое: половину этой цифры подвинул компонент, который к вытеснению воды отношения не имеет.
Величина, за которую он отвечает, называется температурой стеклования: это порог, выше которого застывшая аморфная масса размягчается и молекулы в ней снова начинают двигаться. У чистых веществ её измерили: у глюкозы около 30 °C, у сахарозы 58, у трегалозы 108, у альбумина — 180 °C. Чем сахара отличаются друг от друга и почему трегалоза в этом ряду стоит выше сахарозы, разобрано в статье «Криопротекторы: зачем в раствор добавляют трегалозу». Новое здесь — что белок обходит все три сахара сразу.
Но паспортная цифра чистого вещества и порог реального флакона — не одно и то же. В том же опыте температура стеклования готового состава с одной трегалозой оказалась около 19 °C, а состава с трегалозой и альбумином — около 97 °C. Остаточная вода работает пластификатором: чем её больше, тем ниже настоящий порог, и число 108 на банке с сахаром к этому порогу прямого отношения не имеет. Запас берут большой — лиофилизированные составы принято хранить минимум на 50 °C ниже их температуры стеклования, а чтобы обойтись без холодильника, матрице нужны 80 °C и выше. По той же работе больше семидесяти процентов коммерческих лиофилизатов этого порога не достигают и живут в холоде.
Это не та работа, которую делает маннитол. Маннитол кристаллизуется и выходит из аморфной фазы — его роль разобрана в той же статье про криопротекторы. Альбумин из стекла не выходит: иначе измеренные 97 °C у смеси просто не появились бы.
Обратную подстановку физика не разрешает. Место, которое занимает трегалоза, — это водородные связи, которые до сушки держала вода у поверхности белка-продукта. Чем крупнее и жёстче молекула, тем хуже она в это место встаёт: в опубликованном сравнении сахаров разного размера крупные давали более высокую температуру стеклования, но проигрывали в стабилизации белка, и объясняют это стерическим препятствием; лучше всех сохранил белки самый маленький сахар из набора — та же трегалоза. Альбумин — макромолекула, и к поверхности продукта он так не прилегает. Он работает снаружи, на общей стекловидной массе. В той же работе видно и обратное: добавление к трегалозе крупного полисахарида сильно поднимало температуру стеклования состава и давало белкам лучшую стабильность, чем один этот полисахарид без сахара.
Подход при этом старый, а не экспериментальный: сывороточный альбумин наравне с декстраном и желатином добавляли в сухие вакцины ровно затем, чтобы поднять температуру коллапса сухого вещества, — это зафиксировано в патентной документации отрасли.
Есть цифра, на которой это видно без теории. Дрожжевую культуру высушили с 64 разными защитными добавками и сравнили по росту после восстановления. Четыре знакомые строки из этого списка: обезжиренное молоко — 602 процента к контролю, трегалоза — 479, бычий сывороточный альбумин — 315, сахароза — 157. Поставленный в одиночку, на чужую роль, белок даёт средний результат: воду он не замещает так, как дисахарид, и это читается прямо в столбце.
Тот же вывод подтверждается и с обратной стороны — на сахаре. У растительного фермента диаминоксидазы остаточная активность сразу после сушки составила 75 процентов без добавки, 81 с сахарозой и 83 с трегалозой — разрыв небольшой. Через восемнадцать месяцев хранения он стал заметнее втрое: 43 процента без протектора против 60 с ним. Чем «вещество на месте» отличается от «активность сохранена», разобрано в статье «Лиофилизация ферментов: как сохранить активность».
Оси две — вытеснение воды и температура стеклования готовой массы. Меряются они разными методами, закрываются разными компонентами, и ни одно соотношение из опубликованной работы на чужой состав не переносится: все цифры выше получены на своих продуктах и своих концентрациях. Для вашего состава те же два числа придётся снять заново. Собирать набор и отвечать за него — работа того, кто владеет рецептурой: ни обоснование состава, ни его путь в документы площадке не передаются. На площадке — цикл и его записанные параметры. На контрактной лиофилизации IQFARM стабилизирующую среду согласуют под задачу, сушка идёт в чистых помещениях ISO 7 и ISO 8, на каждый цикл заводится производственная запись, проект идёт под NDA. Как состав поведёт себя на деле, показывает пилотная партия без минимального объёма, от нескольких флаконов, — на ней и появляются ваши остаточная влажность и температура стеклования. Площадка работает с 2013 года, система менеджмента качества построена с учётом требований ИСО 9001 и ИСО 13485. Отправьте состав с долями вспомогательных веществ — с этой строки разговор и начинается.
Можно, если продукту хватает той остаточной влажности и той температуры стеклования, которые даёт состав с одним сахаром. Потолок у трегалозы не нулевой: в разобранном опыте она убрала половину остаточной воды. Достаточно этого или нет — вопрос к двум измерениям на вашем составе, а не к таблице из статьи.
Нет, они работают по-разному. Маннитол кристаллизуется и выходит из аморфной фазы, собирая механическую структуру лиофилизата. Альбумин из аморфного стекла не уходит и поднимает температуру, при которой это стекло ещё держится. Разные задачи и разные признаки того, что компонент сработал.
К тому же классу относят декстран и желатин: в сухих вакцинах их применяли именно для этого — поднять температуру коллапса сухой массы. Что выбрать, решает совместимость с продуктом и его дальнейшая судьба, а не рейтинг компонентов.
Как ориентир — да, как рецептуру — нет. Цифры получены на конкретном продукте, концентрации и среде; при переносе меняются и влажность, и температура стеклования. Эти два числа снимают на своём составе, в пробном цикле.
Опишите продукт и доли вспомогательных веществ: по ним видно, что снимать на пробном цикле. Работа под NDA с первого письма, пилотная партия — без минимального объёма.
Обсудить проект